用細(xì)胞刮刀實驗時 實驗步驟:無菌條件下取新生小牛大腦皮層灰質(zhì)部,4℃D-Hank′s液洗滌4次,至無血跡殘留。剪成1mm3左右的組織碎塊并置于玻璃勻漿器內(nèi),加入兩倍體積的MEM培養(yǎng)基,勻漿上下20次?勻漿液先用100目(直徑149μm)尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾,培養(yǎng)基洗滌4次,收集濾液。然后用200目(直徑74μm)尼龍網(wǎng)布式漏斗抽濾,MEM培養(yǎng)基洗滌4次。細(xì)胞刮刀收集200目尼龍網(wǎng)上的組織(即牛腦微血管),將其置于離心管中,1500r/min離心洗滌10min。離心洗滌的腦微血管懸浮于的0.1%膠原酶中,旋渦振蕩15sec以充分混勻,置于37℃恒溫振蕩水浴箱中振蕩消化50min?取出后旋渦振蕩15sec,1500r/min離心10min,棄上清,用20%BCS的培養(yǎng)基懸浮,接種于明膠鋪被的培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶中加入1%明膠-D-Hank′s液洗滌3ml,37℃孵箱中放置24h,用前倒掉明膠溶液即得明膠覆蓋的培養(yǎng)瓶),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。靜置5~7天后,可見少量細(xì)胞生長,20%BCS的MEM培養(yǎng)液換液,以后每2~3天換液一次,至細(xì)胞長成致密單層后可傳代培養(yǎng)。
1、提前準(zhǔn)備好Matrigel(BD 354277)包被過的六孔板,吸棄孔內(nèi)包被液,加入2ml BeYaMATM 1*培養(yǎng)液。
2、吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內(nèi)的培養(yǎng)液,并用1ml無鈣鎂的PBS洗1遍。
3、加入0.5ml Accutase細(xì)胞分離液使之*覆蓋皿底。
4、室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘,顯微鏡下觀察到大部分克隆細(xì)胞間出現(xiàn)間隙,細(xì)胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時,可吸去Accutase。
5、可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMATM 1*培養(yǎng)液,輕輕搖晃,干細(xì)胞集落基本脫落。亦可用細(xì)胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下,盡量避免用槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞。
6、將制備好的細(xì)胞懸液按1:3-1:6的比例接種至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)板中,注意細(xì)胞過密則克隆邊界不圓滑,易分化,細(xì)胞過稀則克隆存活率降低。
7、輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細(xì)胞均勻分散,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時。
8、每天更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上,或者克隆中央密度過大,影響細(xì)胞生長時進(jìn)行傳代。